聚合物污染土壤的微生物固定化修复

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聚合物污染土壤的微生物固定化修复:

聚合物污染土壤的微生物固定化修复,从大庆油田采油污水污染土壤中筛选出以聚丙烯酰胺为唯一氮源和唯一碳源的4株聚丙烯酰胺降解菌 Rl、R2、R3、Y3。通过游离菌与固定化菌降解聚丙烯酰胺效果的实验数据比较,证明了微生物固定化法降解聚 丙烯酰胺具有优势。因此,采用微生物固定法修复采油污水污染土壤,通过固定化颗粒的制备难易程度、强度、 费用及对聚丙烯酰胺和原油的去除率等条件,比较了 5种包埋固定化制备方法,考察了优选出的包埋固化法对 土壤中污染物的降解能力。结果表明:PVA+海藻酸钠+添加剂法得到的固定化颗粒强度好,操作简单,不易破 损,且费用低,对土壤中聚丙烯酰胺去除率为79.5%,对原油的去除率可达到98.7%。对筛选出的4种菌株鉴定 得知R1为芽孢乳杆菌属,R2为微球菌属,R3、Y3为假单胞菌属菌株。

微生物降解以其特有的无害化处理将成为解决 聚丙烯酰胺引起环境污染潜在毒性的有效手段[3]。 然而,游离微生物在处理含聚污水的过程中菌体易 流失,且污水中的一些有害物质会对微生物产生毒 害作用[4]。而微生物固定化技术可以减轻或消除菌 体的流失,并且使微生物保持活性,可反复使用, 固定化后微生物对有毒物质的承受能力及对有机 物的降解能力都有明显的提高[5]。因此微生物固 定化技术成为生物及环境领域的研究热点[6]。目前, 微生物固定化的制备方法可分为吸附法、共价法、 包埋法和交联法4种[7]。
作者采用微生物固定化方法处理聚丙烯酰胺污 染和石油污染的土壤,从污染土壤中筛选出聚丙烯 酰胺和原油高效降解菌,筛选出的菌株既可以以聚 丙烯酰胺作为唯一氮源又可作为唯一作为碳源被 利用,解决了之前研究中聚丙烯酰胺只能作为微生 物繁殖的氮源不能作为碳源的缺陷。并且选择包埋 固定化方法处理聚丙烯酰胺污染土壤。
1实验材料
1.1 土壤样品
实验用土壤采自大庆油田采油四厂的一口聚丙 烯酰胺与原油污染的井场,在离地表约5?20cm处 取样,将取得的样品装入己经灭菌的样品袋中,密 封。过40目筛,样品放置于冰箱中4°C保存。
1.2培养基
(1)无机盐培养基(g/L): K2HPO4_3H2O1.0, NH4NO3 1.0, KH2PO4 1.0, CaCl2〇.〇2, MgS04-7H20 0.5, FeCl3痕量。
(2)分离、纯化培养基(g/L):向上述(1)的 培养基中加入HPAM 0.5,琼脂1.5%?2.0%,调节 pH值至7.2。
(3)活化培养基(g/L): HPAM0.5, NaC10.5, 蛋白胨 6.0,尿素 9.0,KH2PO4O.5,MgS〇4〇.5。
(4)基础培养基(g/L):向上述(1)的培养基 中加入HPAM0.5,调节pH=7.0。
(5)菌种保藏斜面培养基:牛肉膏蛋白胨培养 基(细菌)和马丁氏培养基(真菌)。
2实验方法
2.1菌种筛选与鉴定
(1)菌种筛选将l〇g聚丙烯酰胺污染的土
壤样品加入到含聚丙烯酰胺100 mg/L,葡萄糖500 mg/L的上述1.2节(1)的无机盐培养基中,HZQ- X100立式恒温振荡培养箱,120r/min, 35 °C下培 养,待培养液变浑浊,吸取5 mL培养液,将移取 的液体加到含聚丙烯酰胺300 mg/L,葡萄糖 300 mg/L的培养基中放入恒温振荡培养箱继续培养,重 复上述过程直到细菌在含聚丙烯酰胺500 mg/L,
葡萄糖浓度为〇 mg/L的培养基中能生长为止。制作 上述1.2节(2)的分离、纯化培养基,接种环挑取 微生物培养液在培养基上划线,划线之后将培养基 放入温度为35 °C,转速为120r/min的振荡培养箱 中培养,待长出菌落后,通过电镜观察菌株是否纯 化。
(2)菌种鉴定微生物菌株的形态观察与生理 生化反应参照常见细菌系统鉴定手册[8]与伯杰氏细 囷鉴定手册。将菌株初步鉴定到属。
2.2测定方法
(1)聚丙烯酰胺降解率的测定:采用淀粉-碘 化镉比色法测定聚丙烯酰胺的浓度。
(2)土壤原油含量的测定:分光光度法[9]。
2.3菌体生物量的测定
采用722型可见分光光度计测定溶液的〇£)660 值(光密度)来表示生物生长量的多少,〇£?值是 物质在溶液中吸收特定波长光线强弱的参数。在波 长为660 nm处对含聚丙烯酰胺的微生物培养液进 行光密度的测量,光密度值与菌群菌数成正比。将 单菌以3%的体积比接入1.2节(4)的基础培养基 中,在35 °C、120 r/min条件下放入振荡培养箱中 培养,以蒸馏水作为空白对照进行测定,以此作为 微生物菌群生长曲线的参考指标。
2.4单一菌种与混合菌降解聚丙烯酿胺和原油的 效果比较
将活化后的单一菌种与4种单菌Rl, R2, R3, Y3的混合菌按照3%的总体积分数分别加入上述 1.2节(4)的基础培养基中,于35°C、120r/min 条件下放入振荡培养箱中培养。3天后测HPAM与 原油的去除率,比较单一菌种与混合菌种对HPAM 和原油的降解效果。
2.5微生物固定化颗粒的制备
(1)制备湿菌体将筛选出四种单菌的混合菌 作为固定化的菌体,将菌株依次接入200 mL的1.2 节(3)所示的活化培养基中,经过4次连续i 取活化后的培养液2 mL加入到200 mL的富#
基中培养2?3天,富集培养基经离心机离心
到湿菌体。
(2)包埋法固定化颗粒的制备4种固定化方
法中包埋固定化法以其操作简单,对微生物活性影 响小,制作的固定化微生物小球的强度高等优点优 于其它3种固定化方法,所以本实验采用包埋法。 以蒸馈水配置一定浓度的包埋载体溶液,加入一定 量的湿菌体,用5 mL注射器吸取载体溶液,将载 体溶液滴入一定浓度的交联剂中,交联一定时间, 将固定化颗粒放入200 mL的1.2节(4)所示的基 础培养基中,35120r/min振荡培养箱中培养降
解聚丙烯酰胺。
(3)5种包埋固定化制备方法采用5种包埋 法进行微生物的固定化,bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐:5种包埋固定化法制备微 生物固定化颗粒的条件如表1所示。
按照表1中的制备条件制备固定化颗粒,比较 5种包埋法制备微生物固定化颗粒的难易程度、小 球强度和韧性以及制备费用,从中选择一种制备费 用低廉、制备容易、强度和韧性都较好的包埋方法。 2.6微生物固定化颗粒降解HPAM和原油的效果 以固定化颗粒对聚丙烯酰胺的降解率与对原油 的去除率来比较几种包埋固定化方法。按照表1中 的5种包埋固定化制备方法,制作固定化颗粒,各 称取10 mL载体与湿菌体的混合物制得的固定化颗 粒,分别放入200 mL的1.2节(4)所示的基础培 养基中,在35 °C, 120r/min振荡培养箱中培养3 天,测聚丙烯酰胺的降解率。
2.7微生物固定化处理采油污水污染土壤
取大庆油田采油四厂的一口井场取回的聚丙烯 酰胺与原油污染土壤,先除去其中的砖块、瓦砾等 杂物后自然风干,再将土样过40目筛,得到颗粒 大小均匀的土样,将土壤样品加入到1.2节(1)所 示的200 mL基础培养基中,测得培养基中聚丙烯 酰胺浓度为500 mg/L,原油浓度为733.21 mg/L。 取10 mL PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的载体与湿 菌体的混合物制得的固定化颗粒放入上述培养基 中,聚合物污染土壤的微生物固定化修复,在35 °C, 120r/min振荡培养箱中培养,每3 天测聚丙烯酰胺的降解率,并采用分光光度法测原 油含量〇
3结果与讨论
3.1菌种筛选结果
经分离纯化得到4株对聚丙烯酰胺有降解效果 的菌种,即Rl、R2、R3、Y3。菌落图片和菌株电 镜扫描图片如图1所示。参照《伯杰氏细菌鉴定手 册》及《常见细菌系统鉴定手册》,可以初步鉴定: R1为芽孢乳杆菌属,R2为微球菌属,R3、Y3为假 单胞菌属菌株。
3.2标准曲线绘制
以HPAM标准溶液浓度为横坐标,可见分光光 度计测得的〇£>42Q值为纵坐标绘制的HPAM浓度 -吸光度标准曲线。曲线的线性回归方程为 j=0.0386x+0.0019,炉=0.9995。测定待测溶液吸光 度值,即可从线性回归方程计算出待测溶液的实际 HPAM浓度。
3.3单菌生物量的测定
以OA560值代表细菌的生物量,菌体生长量越 多,培养基越浑浊,〇£?66〇值越大。因此,〇£)660值 越大。表示菌体生物量越多。微生物生长曲线如图 2所示。
如图2所示,微生物的生长曲线反映=种微生 物在一定生活环境中的生长繁殖和死亡规律。由图 2的生长曲线可以看出,4种菌体在含500 mg/L聚 丙烯酰胺的培养基中生长繁殖,菌体经历了停
表15种包埋法制备微生物固定化颗粒的条件
包埋方法包埋剂/g蒸馏水
/mL湿菌载 体廳比交联剂交联时间
海藻酸钠+活性炭粉海藻酸钠2,活性炭0.5481:24%的 CaCl224 h
海藻酸钠包埋与戊二醛交联结合海藻酸钠2,活性炭0.5481:24%的CaCU.O%的戊二醛戊二醛交联1?2天
PVA+海藻酸钠+添加剂PVA10,海藻酸钠1901:22%的CaCk饱和硼酸溶液CaCk与饱和硼酸共同交联24 h
Si023, CaCO30.3
PVA冷冻PVA4,海藻酸钠1451:24%的 CaCl2于冰箱冷冻室在-15 °C下冷冻过夜,
再在室温下解冻,重复冷冻解冻
明胶一戊二醛明胶201001:21.0%的戊二醛戊二醛交联2天
菌组成的混合菌对HPAM和原油的去除率都明显 高于4种单菌,混合菌对HPAM的降解率在第3天 基本保持稳定,达到55%以上,对原油的去除率可 达到75%以上。这可能是由于单一菌种不具备一整 套完整的酶系统或基因成分降解这些不易降解的 有机物,而微生物群落中不同基因的拥有者却可能 发生基因交换或重组,从而导致新的降解途径的实 现。
3.5微生物固定化
(1) 5种包埋方法比较对5种包埋法的制备 难易程度、固定化后小球的强度和韧性及制作成本 进行对比,结果如表2所示,海藻酸钠包埋与戊二 醛交联结合法与明胶-戊二醛法这两种方法制作费 用高,且明胶-戊二醛法操作较困难,制成的固定化 颗粒形状不规则,海藻酸钠包埋与戊二醛交联结合 法制备的小球韧性、强度一般。因此排除海藻酸钠 包埋与戊二醛交联结合法与明胶一戊二醛法这两 种方法,选用其余3种制备费用低廉的方法测定固 定化微生物颗粒降解HPAM和原油的效果。
滞期、对数期、稳定期和衰亡期。
3.4混合菌的优势
由图3、图4可知,Rl、R2、R3、Y3四种单
图4混合菌与单菌对原油去除率的比较
5种包埋法制备固定化颗粒的难易程度、小球
? 950 ?化 工进展2013年第32卷
表2 5种包埋固定化方法的比较
包埋方法制备难易小球强度和韧性费用
海藻酸钠+活性炭粉操作较简单,成球容易,小球体积较小小球有一定的韧性,但强度不好,易破碎较低
海藻酸钠包埋与戊二醛交联结合操作较简单,成球容易,聚合物污染土壤的微生物固定化修复,小球体积较小小球韧性、强度较一般较高
PVA+海藻酸钠+添加剂操作较简单,成球容易,小球体积较大固定化小球韧性一般,但强度好,球体硬低
PVA冷冻操作相对简便,较易成球,小球体积较小强度一般,韧性很好低
明胶一戊二醛操作较困难,明胶黏性较^:,不易成球,小球的形 状不规则固定化小球强度很好,有靭性较尚.
表3固定化颗粒降解HPAM和原油的效果
包埋方法聚丙烯酰胺的降解率/%原油去除率/%
海藻酸钠+活性炭粉60.381.4
PVA+海藻酸钠+添加剂78.298.3
PVA冷冻61.481.2
强度和韧性以及制备费用比较如表2所示。
(2)微生物固定化颗粒降解HPAM和原油的 效果通过由表2筛选出的3种包埋固定化方法制 得的固定化颗粒对聚丙烯酰胺的降解率的测定,结 果如表3所示,海藻酸钠+活性炭粉法与PVA冷冻 法对聚丙烯酰胺降解率与对原油的去除率低于 PVA+海藻酸钠+添加剂法。因此,排除海藻酸钠+ 活性炭粉法与PVA冷冻法两种方法。
综合表2与表3,得知PVA+海藻酸钠+添加 剂法制得的固定化颗粒的活性较好,操作简单, 强度好,不易破损,且费用低,PVA+海藻酸钠+ 添加剂法对聚丙烯酰胺的降解率高于其它两种 包埋方法。因此选用PVA+海藻酸钠+添加剂法对 含聚丙烯酰胺的土壤进行处理。张秀霞等[1Q]以天 然有机材料YJ-05为载体,采用吸附法制备固定 化MM-7对土壤中石油的降解率可达到27.1%。
由之前的实验3.4节混合菌的优势可知,游离 的混合菌对HPAM降解率达到55%以上,对原油的 去除率可达到75%以上,而由表3得知在相同实验 条件下PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的固定化颗 粒对聚丙烯酰胺的降解率可达到78.2%,对原油的 去处率可达到98.3%。可见固定化后的菌株对聚丙 烯酰胺与原油的处理能力要远远强于没有固定化 的游离菌株。
PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的固定化颗粒如 图5所示。图5(a)为10%PVA-1%海藻酸钠与湿菌体 按1 : 2体积比混合后,加入3 % S i 0 2 ,
0.3%CaCO3。用5 mL注射器注射到2%的CaCl2饱 和硼酸溶液中成球,聚合物污染土壤的微生物固定化修复,CaCh与饱和硼酸共同交联24 h 后的固定化颗粒,颗粒并无拖尾现象。图5(b)为在 相同制备方法时加入3%的活性炭制得的固定化颗 粒,以增加固定化颗粒的通透性,提高微生物的活 性。
3.6微生物固定化处理采油污水污染土壤
PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的微生物固定化 颗粒处理采油污水污染的土壤,处理后的土壤样品 放入电热鼓风干燥箱中干燥后送回井场,固定化颗 粒降解土壤中HPAM和原油的效果实验结果如表4 所示。由表4可以看出,PVA+海藻酸钠+添加剂法 制备的固定化颗粒对采油污水污染土壤进行处理, 固定化颗粒对HPAM、原油的去除率分别为:
和 98.7%。
表4固定化颗粒降解土壤中HPAM和原油的效果
时间
/dHPAM含量 /mgL-1HPAM降解率
/%原油含量 /mg.L_1原油降解率 /%
0500.050733.210
3102.5179.519.598.7
622.2178.31.5184.1
97.6265.70.3676.2
123.2157.80.0975
151.4156.10.0455.6
180.62560.0250
210.27560.0150
4结论
(1)实验以筛选出以聚丙烯酰胺作为唯一碳 源和唯一氮源的菌株为目的,从含HPAM的土壤中 分离、纯化得到对HPAM具有高效降解能力的R1、 R2、R3、Y3四种单菌。对筛选出的单菌进行鉴定 可知:R1为芽孢乳杆菌属,R2为微球菌属,R3、 Y3为假单胞菌属菌株。
(2)将 Rl、R2、R3、Y3 混合,在 35°C, 120 r/min条件下,混合菌对HPAM的降解率可达到55% 以上,对原油的去除率达到75%以上。明显高于4 种单一菌种对HPAM和原油的去除率。
(3)为提高混合菌对聚丙烯酰胺与原油的去除 率,聚合物污染土壤的微生物固定化修复,采用固定化法对混合菌进行固定化实验。比较 5种包埋固定化法得知,PVA+海藻酸钠+添加剂法 对聚丙烯酰胺与原油的去除率高于其它4种包埋固 定化方法。PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的固定化 颗粒的活性较好,操作简单,强度好,不易破损,
且费用低。
(4)游离的混合菌对HPAM与原油的去除率 可达到75%与55%以上,而PVA+海藻酸钠+添加剂 法制得的固定化颗粒对聚丙烯酰胺与原油的去处 率可达到78.2%与98.3%。可见固定化后的菌株对 聚丙烯酰胺与原油的处理能力要远远强于没有固 定化的游离菌株。
(5)PVA+海藻酸钠+添加剂法制备的固定化颗 粒对采油污水污染土壤进行处理,聚丙烯酰胺的去 除率可达到79.5%,原油的去除率可达到98.7%。
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