活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究

发布日期:2015-05-01 16:09:39
  聚丙烯酰胺(Polyacrylamide, PAM)是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的统称,bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐:为线性水溶性高分子的一种,亲水性高,能以各种百分比溶于水,不溶于大多数有机溶剂。它是应用最广泛的水溶性高分子化合物之一,并享有“百业助剂”之称[1],不仅已广泛应用在石油开采、水处理、纺织、造纸、制糖、选矿、医药、 建材、农业等领域,而且在食品、药品以及整容等与人 们日常生活和人类健康相关的领域也都有应用。
  
  在我国,聚丙烯酰胺的消费现状为:采油工业是 第一大用户,占总需求量的80%左右,第二位是水处 理,约占9%,造纸占5%,矿山占2%,其他占3%。在 采油工业中,聚合物驱油3次采油技术已进入大面积工业化推广应用阶段[2]。聚合物干粉年注人量已达万 吨以上,预计到2010年,我国石油开采行业PAM需 求量为10~ll万t,占总需求量的活性污泥80%左右,其规模 在世界处于遥遥领先地位[3]。伴随而来的是大量含有 一定浓度及保留一定黏度的聚合物产出水,大庆油田 有些采油厂采出水中PAM的浓度己经高达l 000 mg ? L-1以上[4]。含聚丙烯酰胺(PAM)污水中残留单体丙烯 酰胺(AM)的毒性很大[5],如直接排放,将在环境中逐 渐积累,危害环境,然而现有工艺无法满足处理要求, 需要对PAM降解的途径和机理进行全面深入的研 究,寻找合适的处理方法。
  
  本文从胜利油田的活性污泥中初步筛选到3株 聚丙烯酰胺降解菌,通过探索性实验筛选出适合微生 物降解聚丙烯酰胺的优化条件。
  
  l材料与方法l.l实验仪器DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器、SHP-150生化 培养箱、LDZX-50FAS立式电热压力蒸汽灭菌器、 YS100显微镜、721型分光光度计、pH计、红外光谱仪 (AVATER360FT-IR)、高效液相色谱仪(Agilent1100)。 l.2培养基基础培养基(g-L-1):蛋白胨5,牛肉膏l0,NaCi 5。 去离子水1 000 mL。
  
  降解培养基(g*L-1):聚丙烯酰胺0.3,葡萄糖2, NaNO31,KH2PO41.5,K2HPO41.5,MgSO4 0.5。去离子水 1 000 mL。
  
  1.3菌株的筛选和分离活性污泥中许多微生物接触一段时间后才具备 降解抑制物的能力,因此需对污泥进行驯化。将100 mL胜利油田的活性污泥加到盛有1 000 mL的基础培 养基的烧杯中,置于(35±1)C的恒温槽中,用鱼缸充 气器进行曝气。先培养活化3 d后,每72 h更换1次 混合液,逐步增加含聚污水的浓度(聚丙烯酰胺浓度: 50~500 mg.L-1),培养驯化45 d后进行细菌分离。
  
  用平板划线法分离细菌,将平板置于37 C的生 化培养箱中培养48 h后,再挑取不同形态的菌落进 行平板划线纯化细菌。根据菌落形态和显微镜观察结 果,重复划线分离,直到得到纯细菌。然后再对筛选出 的菌种进行生理生化鉴定。
  
  1.4分析方法1.4.1聚丙烯酰胺质量浓度测定采用浊度法生物降解率!(%)的表达式为:!=(C0-Cl)/C0xl00%式中:C0表示降解前的聚丙烯酰胺含量,mg ? L-1 ; C1表 示降解后的聚丙烯酰胺含量,mg*L-1。
  
  1.4.2红外光谱分析聚丙烯酰胺干粉和微生物降解产物,用光谱纯 KBr压片后进行红外光谱分析。
  
  1.4.3高效液相色谱分析色谱条件:Agilent ZORBAX XDB-C18 柱(3.0 mm x250 mmx5 !m);流动相为Mili-Q水;流速为0.4 mL.min-1;紫外196 nm处监测;进样量为50 !L。此方 法对丙烯酰胺的检测灵敏度为ppb级[6]。
  
  2结果与讨论2.1细菌的筛选和鉴定从胜利油田的活性污泥中筛选到3株聚丙烯酰 胺好氧降解菌,分别命名为AS-l、AS-2和AS-3。根 据形态观察和生理生化鉴定,初步鉴定为:AS-l为脂 肪杆菌属,AS-2为海球菌属,AS-3为动性球菌属。
  
  2.2细菌的生长曲线测定测定细菌生长曲线了解其生长繁殖规律,这对有 效地利用和控制细菌的生长具有重要的意义。在适宜 的条件下,培养细菌要经历延迟期、对数期、稳定期和 衰亡期4个阶段。
  
  采用浊度法分别测定了 AS-l、AS-2和AS-3以 及混合菌在降解培养基中的生长曲线,结果见图1。 从图中可以看出,3株菌和混合菌在前5 h内生长缓 慢,处于生长的延迟期。5 h后细菌浓度大大增加,开 始进入细菌的生长对数期。11 h后,细菌的生长又开 始趋向平缓,这时进人了稳定期,持续一定时间后,细 菌浓度开始减少,进人衰亡期。其中菌株AS-2的生长较快,细菌浓度较大,是优势菌种。
  
  2.3单株菌和混合菌的降解能力比较环境污染物的降解有时可通过单株细菌完成,有 时也需要多株细菌间的协作来完成的。同时多株菌共 存可能存在协同作用,提高单株菌对降解物的降解效 果,也可能存在拮抗作用,降低单株菌对降解物的降 解效果。所以,将3株菌正交混合后在降解培养基中 培养,考察对聚丙烯酰胺的降解效果,结果见图2。 6.5、7、7.5、8、8.5、9。在 35 ",140r.min-1 的恒温摇床中振荡培养5 d后测定聚丙烯酰胺的浓度。实验结果 见图4。
  
  从图4可以看出,不同的初始pH值对聚丙烯酰 胺的降解有较大的影响。pH值在7#8之间时,聚丙烯 酰胺的降解效果较好。降低或增大pH值,聚丙烯酰 胺的降解率都减小。当pH=8时,聚丙烯酰胺的降解 率最高,达到33.29%。
  
  o 53 20 5 0 52 '—i '—_%/MVd iocoCOPBJl——(BAOln9y0 AS-1 AS-2 AS-3 AS-1,2 AS-1,3 AS-2,3 AS-1,2,3 Different combinations of bacterium图2单株菌和混合菌的降解能力的比较 Figure 2 The comparison of degradation rates of singIe bacterium and mixed bacteria不同菌株对聚丙烯酰胺的降解能力存在差异,菌 株AS-2的降解效果最好,菌AS-1和AS-3对聚丙烯 酰胺的降解效果不明显,并且菌AS-1和AS-3对菌 AS-2有明显的拮抗作用。混合培养的降解效果都不如 单株菌AS-2的降解效果。所以菌AS-2为降解聚丙烯 酰胺的优势菌,在后续的实验中对其作深人研究。
  
  2.4菌AS-2降解聚丙烯酰胺的条件优化 2.4.1最佳反应时间的确定将菌AS-2接人250mL的降解培养基中,在37 ",140 ?min-1的恒温摇床中振荡培养,间隔一定的 时间测定聚丙烯酰胺的浓度。
  
  从图3可以看出,在前5 d内,菌AS-2对聚丙烯 酰胺的降解效果明显,在第5 d的时候,聚丙烯酰胺 的降解率达到40.51%。而后,随着降解时间的延长, 聚丙烯酰胺降解率增长缓慢。这可能是菌AS-2的代 谢产物所致。由于过长的降解时间不但增加处理成 本,而且不利于实际应用。所以,选取菌AS-2降解聚 丙烯酰胺的最佳时间为5 d。
  
  2.4.2初始pH的确定不同的微生物有其最适宜的生长pH值范围,同 一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过 程中,也要求不同的最适宜的pH值。将菌AS-2接人 降解培养基中,分别将pH值调为2、3、4、5、5.5、6、2.4.3温度的确定将菌AS-2接人降解培养基中,温度范围为25# 55 ",pH=8,静置培养4 d后测定聚丙烯酰胺的浓 度。 温度对聚丙烯酰胺降解率的影响见图 5。 当温度 为30#45 "时,AS-2对聚丙烯酰胺的降解效果较好, 在40 "时,聚丙烯酰胺的降解效果达到最好,降解率 达到32.25%。继续升高温度,聚丙烯酰胺的降解率大 幅度下降。所以,40"为最佳降解温度。
  
  2.4.4最佳碳源的确定分别选取了 NaHCO3、乙酸钠、橄榄油、可溶性淀 粉、原油、葡萄糖、蔗糖为碳源,其含量均为2 g*L-1,25303540455055T emperature/C图5温度对降解率的影响 Figure 5 The effect of temperature on degradation ratespH为8,在37 C,140 r.min-1的恒温摇床中振荡培养 5 d后测定聚丙烯酰胺的含量。从图6可以看出,碳源 为葡萄糖时,菌AS-2对聚丙烯酰胺的降解效果最 好,降解率达到40.73%,碳源为原油时,降解率较低, 为29.70%。但油田的含聚污水中同时也含有原油,所 以从实际应用考虑,选取原油为碳源。
  
  2.4.5最佳氮源的选择分别选取了 NaNO;、尿素、硫酸铵、蛋白胨、NH4CI 为碳源,其含量均为lg.L-l,pH为8,在37C、140r. min-1的恒温摇床中振荡培养5d后测定聚丙烯酰胺的 含量。从图7可以看出,氮源为NaN〇3时,菌AS-2对 聚丙烯酰胺的降解效果最好,降解率达到43.75%。 2.4.6碳源、氮源含量的确定分别考察了原油和硝酸钠含量对菌AS-2降解 聚丙烯酰胺的影响(结果见图8,图9)。实验表明,当 原油含量为2.5 g-L-1,硝酸钠含量为1.4 g-L-1时,菌 AS-2对聚丙烯酰胺的降解效果最好,分别达到了 33.83%和 45.23%。
  
  050505054 3 3 2 2 1 1%/svd-M-loco!=:OPB!-ll——(扣 Aom€y-5 0 5 0 5 0 53 3 2 2 1 1%/sVJ jo SU0P2 PAOiy0L0.5l.01.52.02.53.03.54.0Crude oil content/g ? L-1图8碳源含量对降解率的影响Figure 8 The effect of crude oiI content on degradation rates_L_Jq_L_lo9pmo^ EOO^EUItc,u itlo:}!?Iffe I D_l_IoJ。
  
  -vL-sUBSBJq'ce!
  
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  _J_J€soonTb图6碳源种类对降解率的影响Figure 6 The effect of different carbon sourced on degradation rates00004 3 2 1%/sv J JO SLI0--32 PAOS9y000005 4 3 2 1%/sVJ JO SU0P2 PAOiK00.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0NaN〇3 content/g ? L-1图9氮源含量对聚丙烯酰胺的影响 Figure 9 The effect of NaN〇3 content on degradation rates^3l——(q031?
  
  D5J.N:9U0-I_ld9dces lr( 5s015 Itrc8VH53nt图7氮源种类对降解率的影响Figure 7 The effect of different nitrogen sources on degradation rates3囷AS-2对聚丙烯酰胺结构的影响分别对聚丙烯酰胺降解前后的样品进行了红外 扫描(图10、图11)。从图中可以看出,经过菌AS-2 降解后的聚丙烯酰胺的红外光谱图发生了明显的变 化。降解后聚丙烯酰胺的谱图中的3 300~3 500 cm-1 处附近-NH2的伸缩性振动特征吸收峰明显变弱,说 明了微生物主要降解了聚丙烯酰胺侧链上的酰胺基。 根据1 364 cm-1和920 cm-1附近出现新的吸收峰,可mAU8006004002000rvuocyU寸。:PZL 66S-I—I)()
  
  5012345678图11丙烯酰胺标样的高效液相色谱图Figure 11 The HPLC picture of AM standard sample以确定体系中的羧基的存在。1 462 cm-1处的峰消失和 1082 cm-1处的峰明显变宽变强,说明氨基可能从聚 丙烯酰胺侧链上脱落下来成为游离的氨基。同时, 530"995 cm-1处出现的几个强的吸收峰代表了芳香 化合物,可能是微生物的代谢产物。所以,可以推断菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的侧链,把酰胺基降解 成了羧酸和游离的氨基。
  
  4丙烯酰胺单体的测定聚丙烯酰胺本身基本无毒,但是它的单体,丙烯 酰胺(Acrylamide,AM)的毒性却很强,它是神经系统致毒剂,对神经系统有损伤作用,中毒后表现为肌体 无力和运动失调等症状[7]。因此,在PAM的使用过程 中人们非常关注是否有单体释放出来。本文用高效液 相色谱法考察了生化过程中是否有丙烯酰胺单体产 生(图11、图12)。
  
  从图中可以看出,丙烯酰胺标样的保留时间为 3.227 min,而降解后的PAM溶液的3个峰的保留时 间分别为1.902、2.715、2.929 min,均不在丙烯酰胺出 峰处。说明经生化处理后的PAM溶液中没有丙烯酰 胺单体生成。用高效液相色谱检测生化后的PAM溶 液,未检测出单体丙烯酰胺。
  
  mAU500400 -30020010000图12生化后PAM溶液的局效液相色谱图 Figure 12 The HPLC picture of PAM after biodegradation5结论(1)从胜利油田的活性污泥中筛选出3株聚丙烯 酰胺降解菌,通过比较筛选出一株降解效果较好的菌 AS-2。研究了 AS-2对聚丙烯酰胺生物降解的最佳条 件。结果表明,当降解时间为5 d、pH=8、温度为40 #、碳源为原油、氮源为NaNO;、原油和NaNO3的含量 分别为2.5、1.4 g,L-1时,AS-2对聚丙烯酰胺的降解 率达到45.23%。
  
  (2)分别对聚丙烯酰胺降解前后的样品进行了红 外扫描。经过菌AS-2降解后的聚丙烯酰胺的红外光 谱图发生了明显的变化。经过红外分析,可以推断菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的侧链,把酰胺基降解 成了羧酸和游离的氨基。结果表明,菌AS-2对聚丙 烯酰胺具有较强的生物降解功能。用高效液相色谱检 测生化后的PAM溶液,未检测出单体丙烯酰胺。