马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

发布日期:2014-12-28 20:12:24
马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:
马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,以马铃薯品种早大白、黄麻子、克新13、荷兰15、大西洋为试验材料,bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐:提取基因组DNA,进行SSR标 记,并将标记产物进行聚丙烯酿胺凝胶电泳,比较不同电泳参数(聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电泳电压、染色方法)对电 泳结果的影响。确定了适合马铃薯SSR标记的电泳检测体系,即聚丙燃酿胺凝胶的浓度为12%,电泳电压为170V,染 色方法为溴化乙锭染色。
微卫星序列又称简单序列重复(Simple sequ¬ence repeat, SSR) , 是广泛分布于真核生物基因组 中的高度重复序列。在动植物研宄方面,目前已成 为遗传连锁分析、基因定位以及遗传标记图谱构建 等领域一个极为重要的研究手段典型的微卫星 DNA重复单位的核心序列为2~6 bp,重复次数为 10~20 次,长度一般为 100~300 bp。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel elec- trophoresis, PAGE)技术由于其检测灵敏和分辨率高 的特点,特别适合于小片段多态性扩增产物条带的 检测,并且分离效果好,分辨率高。理论上,不同 浓度的凝胶在一定范围内,凝胶的浓度越大,分辨 率越高,对长度差异片段区分性越好,越有利于基 因型的判断。扩增片段检测目前主要采用溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB)染色与硝酸银染色[3]。银染 由于染色背景较深,非特异性条带较多,品种之间 的特异性条带不易区分,不利于进行品种纯度方面 的鉴定分析[4];聚丙烯酰胺淬灭EB的荧光,使EB 染色的灵敏度降低,但是此方法操作时间短、程序 简单、背景颜色浅、成像容易,使得SSR扩增的 多态性目的条带带型清晰,数量也能够满足实验分    
析要求。另外,EB染色结果具有一致性,重复性 好的优点,马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,成为品种鉴定方法中条带染色的首选方
法。
本试验拟通过对聚丙烯酰胺凝胶电泳参数的分 析,确立马铃薯品种纯度鉴定中标记产物的最佳电 泳体系,以满足试验分析的需要,同时为马铃薯主 栽品种DNA指纹图谱的构建打下理论基础。
i材料与方法
1.1试验材料
本试验选用的马铃薯为黑龙江省主栽品种,由 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供(表
1)。
SSR标记所用引物序列由加拿大蒙特利尔麦吉 大学科研组提供(表2),并由上海生工生物技术公 司合成;其它试剂(TaqDNA聚合酶等)均购自大连 宝生物试剂公司。
表1试验用马铃薯品种
序号品种名称级别
1早大白原原种
2黄麻子原原种
3克新13号原原种
4荷兰15原原种
5大西洋原原种
 
表2 SSR标记所用引物序列情况
引物编号序列顺序(5'到30
SSI-FTCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AAC
SSI-RTCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGA
Patatin-FCAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CC
Patatin-RTGG TCT GGT GCA TTA GAA AAA A
STM0014-FCAG TCT TCA GCC CAT AGG
STM0014-RTAA ACA ATG GTA GAC AAG ACA AA
UGP-FGAA ACT GCT GCC GGT GC
UGP-RTGG GGT TCC ATC AAA C
电泳操作如上,比较不同电压电泳结果的差异。
表3不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制
凝胶浓度5%8%12%16%
30%丙烯酰胺储液(mD1.662.6645.2
5xTBE (mD2222
10%过硫酸胺(APS) (pL)100100100100
四甲基乙二胺(TEMED) (pD10101010
双蒸水(mL)6.845.8442.8
分离的DNA大小(bp)80-50060-40040-20020-100
 
1.2试验方法
1.2.1马铃薯块茎DNA提取
米用Isolation buffer提取液提取马铃著DNA, Isolation buffer 提取液配方如下:100 mM Tris (pH 8.0) , 50 mM EDTA (pH 8.0) , 1.3 M NaCl, 0.2% SDS, 0.5% Triton X-100, 1% PVP, 10 mM DTT, 60 mM b-mercapto ethanol,其它操作步骤同 一般SDS提取方法R6],并用Alpha Innotech公司的 December 2006型紫外凝胶成像仪检测结果。
1.2.2SSR 标记
PCR反应体系(20 |xL): lOxPCR 缓冲液 2 |xL, 10 mM dNTPs 0.8 )xL, 25 mM MgCl2 2.4 (xL, Taq DNA 聚合酶(5 U /fxD 0.15 |xL, 4mM上游引物1 |xL, 4mM下游引物1 |xL,灭菌双蒸水11.65|xL,模板DNA60ng。
PCR扩增程序:
95T:预变性5 min; 94T;变性30 s, 48.5丈复 性45 s, 72X:延伸90 s,共35个循环;72T;延伸 7 min,在 Biometre 公司 T-Gradient Thermoblock 型 号PCR扩增仪上扩增,产物4丈保存。
PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,EB染 色,紫外凝胶成像仪检测结果。
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳参数分析
(1)不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较
分别配制5%、8%、12%、16%的聚丙烯酰 胺凝胶,所需各种试剂及用量如表3,预电泳 30 min 后,取 PCR 产物 5|xL 与 l|xL 6-Loading Buffer混匀,上样,电泳,EB染色,紫外凝胶成 像仪检测结果。
(2)电压变化对电泳结果的影响
设置电压梯度为330V、250V、170V、90V,
(3)凝胶染色方法比较
①银染方法:
A.银染液的配制:固定液(100 mL冰乙酸加水 稀释至 1 000 mL);染色液(2g AgN03、1.5 mL 37%甲醛,加水稀释至1 000 ml);显色液(30 g Na2C03、1.5mL37% 甲醛、0.2mLNa2S2O3,加水 稀释至1 000 mD ;终止液(10%冰乙酸。
B银染法操作:固定30 min—去离子水洗涤5~ 10 min—染色30 min—去离子水洗涤2次(每次不 超过30 a)—显色至所要程度—终止显影。
②溴化乙锭(EB)染色:
将EB贮液(10 mg*mL-〇用双蒸水稀释至 0.5将电泳后的凝胶放入染色液中30
min,染色后的凝胶放入蒸馏水中清洗5 min,再 将凝胶放入紫外凝胶成像仪观测结果。
2结果与分析
2.1 DNA提取结果
将5个马铃薯品种提取的DNA,各取5 jxL, 与1 |JLL 6-Loading Buffer混勾,马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,用1%琼脂糖凝胶, 100 V电压,电泳30 min,结果用紫外凝胶成像仪 检测。从电泳结果可以看出,用Isolation buffer提
取液提取的马铃薯DNA,质量好,主带唯一,无 拖尾和弥散,能够满足SSR标记的要求(图D。
2.2不同参数电泳结果比较
2.2.1不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶,凝胶的孔径大 小、分辨率不同,分离效果也明显不一样(图2)。 凝胶浓度较低时_5%,胶的分辨率明显不好,SSR 标记扩增的多态性条带数量少,带型模糊,不利于 带型区分、品种区分;12%和8%浓度的凝胶相比, 多态性条带数量多,带型清晰,品种之间的区分更 明显;16%浓度的凝胶电泳,多态性条带数量并没 有较12%浓度的凝胶有明显的增加,并且由于电泳 时间过长,单一条带反而有些离散,不如12%浓 度的凝胶条带集中、明亮,同时配制16%浓度的 凝胶所需要的相关试验试剂的用量也比较大,试验 成本也会相应增加。 
 
2.2.2不同电压下的电泳结果
在实际电泳操作中,不同电压下的电泳对应的 时间、电流参数如表4。
表4不同实际操作电压下的时间、电流参数值
申压CV)工作参数
电流(mA)时间(min)
3309280
25057150
17046260
9026460
在330V电压下,电泳只需要80 min就能完 成,但是因为电泳速度过快,标记的多态性条带不
能完全分离开来,并且条带不清悉;90 V电压下, 电泳结果比较好,能够满足实验分析的需要,但是 电泳时间太长,接近8个小时;250 V、170 V电 压均能将泳道中的多态性条带分开,满足试验分析 的需要,并且,170 V电压电泳,多态性条带更清 晰,可以采用(图3)。
2.2.3PCR标记产物不同染色方法的结果比较 EB染色,多态性条带清晰,背景浅,并且同 一品种多次扩增成像一致,便于实验结果分析;银 染法随着时间的增长,背景逐渐加深,显示的多态 性条带数目增多,目的条带相近的细小条带(俗称 影子带)也在増多,若对目的条带带型不是很了 解,马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,则不利于基因型的判断,对多态性信息量、简 单匹配系数等的试验分析也容易出现错误。
果如图4。 
200
100
 
图4SSR标记产物不同染色方法结果比较
1 一标记产物EB染色结果;2—银染20 min结果;
3—银染30 min结果;4一银染50 min结果;5—银染70 min结果。 (泳道马铃薯品种顺序与表1相同,M为标准分子质量 
3结果与讨论
SSR标记与其它标记方法(RFLP、RAPD、 AFLP等)相比,具有共显性遗传,符合孟德尔遗传 规律,数量丰富,分布均匀,覆盖整个基因组, 试验重复性好,结果可靠性高等优点[7,8],是马铃 薯品种纯度鉴定分析的理想的分子标记。SSR标记 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的检测方法, 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨力极高,用于测序的聚 丙烯酰胺凝胶可分离相差1 bp的DNA片段,能 够将品种特异性的谱带分离出来,进而判定纯度 和真实性。但是对凝胶结果影响因素较多,不同 的试验处理对成像结果都有影响,影响大g 于不能进行试验结果的分析,因此,需要^ 烯酰胺凝胶电泳参数进行优化,聚丙烯酰胺凝胶的 浓度、电泳时间都是其中重要的参数,试验结果表 明:在聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%、电泳电压 为170V的情况下,马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,PCR标记产物多态性条带清晰、 明亮、稳定,便于试验分析与交流。PCR扩增产 物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,目标产物的检测 主要采取显色法。目前大多采用同位素放射自显影 法、荧光染料标记法、EB染色法和银染法,放射 自显影法操作过程比较繁琐,且操作者容易遭受同 位素照射的危险,在推广应用中有一定的难度;荧 光染料标记法操作过程同样繁琐,试验成本较高; 银染法其检测的灵敏度接近于同位素检测,但是整 个银染检测操作步骤也非常繁锁,染色花费的时间 也较长(染色1次约需要2 h),同时,使用到的配 制试剂较多,试验稳定性也难以控制,不利于品种 鉴定[9]; EB染色法方便易行,时间短,全程只需要 35 min,操作比较简单,只需要配置一种溶液,采 用两个步骤,紫外凝胶成像仪成像方便,并且EB 染色结果稳定,利于试验分析。但是EB具有致癌 性,对人身体健康有害,因此,找到一种更好的染 色方法,既有利于试验分析,又不危害身体,对 SSR标记方面的研究是非常必要的。
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