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dna聚丙烯酰胺凝胶电泳

发布日期:2014-08-22 15:54:43
dna聚丙烯酰胺凝胶电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳,电泳的驱动力靠dna聚丙烯酰胺凝胶电泳骨架本身的负电荷。 
聚丙烯酰氨(PAGE)凝胶电泳用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离。电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。蛋白质电泳(一般指SDS-PAGE)根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。 
 
所以相同点就是样品都是带负电荷的,从负极向正极移动,移动的距离都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时,可以考虑换用琼脂糖凝胶,因为该体系孔径大。相反,如果需要精确到各位数碱基的dna聚丙烯酰胺凝胶电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统,因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。 
不同点首先是样品不同。这个就不用多说了。其次是结果的观察方法不同。dna聚丙烯酰胺凝胶电泳普遍使用EB做染料,在紫外灯下观察;而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色,还需要经过脱色步骤,不过观察起来比较简单。还有就是胶体系的差别,dna聚丙烯酰胺凝胶电泳通常是一胶跑到底,而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。 
电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。但是,区分这些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数,是因为这些样品的电荷/分子量比都是恒定的了。以DNA分子为例,它在电泳中的移动是靠其骨架中磷酸所携带的负电荷来实现的,而这个磷酸分子又是每一个核苷酸中都有的,所以DNA分子所携带的负电荷数是由其核苷酸总数决定的。而且,dna聚丙烯酰胺凝胶电泳分子中核苷酸的组成动辄成百上千,在如此大的分子量面前,讨论单个核苷酸之间分子量的差别就显得毫无意义。这样,DNA分子中负电荷的量就可以用DNA的分子量来代替,反过来,DNA的分子量也就可以用DNA分子所携带的电荷来代替(一句话,dna聚丙烯酰胺凝胶电泳的电荷/分子量比是恒定的)。 
这在蛋白电泳中(特别是SDS-PAGE中)是一样的。在SDS-PAGE中,bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐:SDS将蛋白质变性成直线分子并紧密包裹于其上,使得其所携带的电荷与蛋白分子量成了一定的比例,剩下的就和核酸电泳一样了。 
至于为什么核酸的横着跑,蛋白竖着跑,个人认为最大的问题是蛋白制胶的过程导致的。蛋白制胶由于使用了两种不同的凝胶系统,所以需要一个水平的分界面。这个分界面在配胶的过程中是依靠异丙醇在重力作用下的压力下形成的。所以,一并就竖着跑了~~
一.琼脂糖水平平板凝胶电泳
  
  琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
  
  琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 
  1、 DNA的分子大小: 
  线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与dna聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。 
  2、 琼脂糖浓度
  一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 
  
   表 琼脂糖浓度与DNA分离范围
  琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
  线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
    
  3、 DNA分子的构象 
  dna聚丙烯酰胺凝胶电泳分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 
  
  4、 电源电压 
  
  在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 
  
  5、嵌入染料的存在 
  
  荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。 
  
  6、 离子强度影响 
  
  电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 
  
  对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
  
  琼脂(糖)电泳常用缓冲液的pH在6-9之间,离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时,会有大量电流通过凝胶,因而产生热量,使凝胶的水份量蒸发,析出盐的结晶,甚至可使凝胶断裂,电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变,可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液,混匀后再用。
  
  
  二.聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳(PAGE; polyacrylamide gel electrophoresis)
  
  聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,具有分子筛和电泳的双重作用,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的dna聚丙烯酰胺凝胶电泳,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。
  
  聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大,回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.
  
  聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N'一亚甲 双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.
  聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的,不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2.
  
  丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青* 
  
   3.5 100~2000 100 460 
   5.0 80~500 65 260 
   8.0 60~400 45 160 
   12.0 40~200 30 70 
   15.0 25~150 15 60 
   20.0 10~100 12 45 
  *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
  
  根据分离dna聚丙烯酰胺凝胶电泳片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶.
  
  1.按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
  
  2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角.
  
  3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.
  
  4.加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液 体接近溢出时为止.
  
  5.立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使 成10°角,可减少液体泄漏的机会.
  
  6.室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE 缓冲液.
  
  7.小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产 生不规则的表面,将导致以后DNA电泳带型不规则.
  
  8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品孔内,加样时不 要产生气泡.
  
  9.接好电极,电压为1-8V/cm,进行电泳.
  
  10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.
  
  11.电泳毕,切断电源,弃去电泳仪,取出胶床板,小心移去一块玻 璃板,让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中,15~30min后取出水洗紫外仪下观察结果.
  
  12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度,可用银染.
  
 dna聚丙烯酰胺凝胶电泳浓度的选择
根据所分离蛋白质的相对分子质量范围选择最适凝胶浓度,5%的凝胶最适于分离蛋白质的相对分子质量范围是25000~200000,10%的凝胶最适于分离蛋白质的相对分子质量范围是10000~70000,3.33%的凝胶可用于分离相对分子质量更高的蛋白质。
【基本原理】
随着蛋白质分离技术的发展,人们已将聚丙烯酰胺凝胶电泳引用到核酸研究上。使用2.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以依次将4s tRNA、5sRNA、mRNA及16、18、23、26s的rRNA分开。电泳分离后,再用次甲基蓝染色。由于4s的tRNA及5sRNA分子量较小,当电泳时间太长或胶条太短时,很易泳出胶条之外,如果需要对它们专门研究,应换用5%的聚丙烯酰胺凝胶。
对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等一般可采用胶中孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
【操作方法】
1、聚丙烯酰胺凝胶制备
(l)装板:先将玻璃板和1mm垫条彻底洗净、晾干 长玻璃和短玻璃之间两测放入1mm垫条,把长玻璃和短玻璃及垫条对齐,用透明胶带密封两测及底边。
(2)配胶(2.4%)①:凝胶灌注和聚合 取 4ml 制胶贮存液(15%丙烯酰胺-7.5%双丙烯酰胺混合液 试剂1),12.27ml水及 8.33ml 3E缓冲液(试剂2)混匀,放在真空于操器中抽去制胶贮存液中的空气,待液体沸腾30秒后,取出,加入 0.2ml 10%TEMED溶液和 0.2ml 10%过硫酸铵溶液,再混匀。立即将此液灌到已封闭的玻璃板间,使玻璃板与平面成 45°角放置,后再小心地加上 3-5mm 高度的水层覆盖在胶的表面。自加入过硫酸铵起,到水封为止,全部操作应不超过 20min。室温下任其自然聚合,当天使用。该胶板也可在室温下放置过夜后使用。
制备5%胶的步骤,除去应取 8.33ml 制胶贮存液, 7.94ml水及 8.33ml 3E及缓冲液外,以下各步皆同上,只是因5%胶更易聚合,所以动作应更迅速。5%胶柱应于当日制作,当日使用(tRNA于此胶中每小时泳动2cm)。
2、加样:用滤纸条吸去胶柱上面的覆盖水层,将胶板的透明胶带取下,固定于电泳槽中,向槽中灌入电极缓冲液(试剂3)。 
取10µL样品溶液,再加入 2µL 0.2g/L的溴酚蓝指示剂,混匀后,用微量注射器将含有指示剂的样品蔗糖溶液小心地转移,加到胶板顶端的加样槽中。取已知的样品作为标准,与未知样品一起泳动,用以帮助鉴定未知样品分子量大小。
3、电泳:样品加入后,上槽接负极,下槽接正极,打开电流仪进电泳。
电泳条件:10一15V/cm,本实验所需电压为60-100V。溴酚蓝指示剂区带移动到距胶板下端约l厘米处,停止电泳。
4、染色与固定:电泳结束后,将两块玻璃板剥开,小心将胶取出放入培养皿,加入10ml 1M醋酸固定20min,再放入次甲基蓝染色液内染色4h左右。然后在蒸馏水中浸泡脱色,不断地更换蒸馏水,直至胶板背景洗净,然后将胶板浸在7%醋酸中固定。
5、测量、绘画。
【材料与试剂】
(1)制胶贮存液(15%丙烯酰胺-7.5%双丙烯酰胺混合液):称取7.5g丙烯酰胺,0.375g 双丙烯酰胺溶于50ml水中。
(2)3E 缓外液(0.12M Tris-0.06M 醋酸钠-0.003M EDTA,pH7.4 缓冲液)。
称取14.54g Tris, 8.2g 醋酸钠,1.1g EDTA溶于水中,用冰醋酸调至pH7.4,稀释到1000ml。
(3)聚丙烯酰胺电泳电极缓冲液(O.004M Tris-0.02M 醋酸钠-O.001M EDTA,pH7.4缓冲液)。
(4)蔗糖溶液:40%(W/V)蔗糖水溶液。
(5)0.2%次甲基蓝染色液:0.2g次甲基蓝溶于100ml 0.2M 醋酸-0.2M 酣酸钠溶液中。
(6)0.02%溴酚蓝指示剂。
(7)1M醋酸溶液。
(8)琼脂糖(粉末,A.R.)。
(9)10%TEMED。
(10)10%过硫酸铵。
(11)7%醋酸。
(12)核糖核酸样品溶液:实验四所得RNA溶液或1.5mg 酵母RNA溶于是1ml 40%蔗糖水溶液中配制而成。
【实验器材】
①垂直板型电泳槽及配件;②直流稳压电源;③白瓷板;④透明胶带;⑤日光灯;⑥微量注射器;⑦细长头的滴管;⑧培养皿。
凝胶电泳(英语:Gel electrophoresis)或称胶体电泳 是一大类技术,被科学工作者用于分离不同物理性质(如大小、形状、等电点等)的分子。凝胶电泳通常用于分析用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法(如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。可分为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳、 脉冲电场凝胶电泳。
凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置 在电 场当 中时 , 它们 就会 以一定 的速 度移向适当的电极 , 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 , 叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多 ,其迁移的速度也就越快 , 反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质 , 如琼脂糖凝胶和聚丙 烯酰胺 胶等 , 从而降低了对流运动 , 故 电泳 的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩 擦系数 是分 子的大 小、极性及介质 粘度 的函数 , 因此根据分子大小的不同、 构成或形状的差异 , 以及所带的净电荷的多少 , 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下 ,核酸分子的糖- 磷 酸骨架中的磷酸基 因 呈离子状态 ,从这种意义上讲 ,D N A 和 R N A 多核苷酸链可叫做 多聚 阴离 子 ( P ol yani o n s ) 。因 此 , 当核 酸分 子 被放 置在 电场中时 , 它们就会向正电极的 方向迁 移。由 于糖- 磷酸 骨架 结构 上的重 复性 质 , 相同 数量 的双链 D N A 几乎具有等量的净电荷 , 因而 它们 能以 同样 的速 度向 正电 极 方向 迁移。 在一 定的电场强度下 , D N A 分子的这种迁移速度 , 亦即电泳的迁移率 , 取决于核酸分子本身的大 小和构型 , 分子量较小的 D N A 分子比分子量较大的 D N A 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离 D N A 片段的基本原理。
琼脂糖 ( Agarose ) 是一种线性多糖聚合物 , 系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的 电泳介 质 , 其密 度是由 琼脂 糖的浓 度决 定的。经过化学修饰的低熔点 (LMP) 的琼脂糖 , 在结构上比较脆弱 , 因此在较低的温度下便会熔化 , 可用于DNA片段的制备电泳。
聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式 : 一是用于分离和纯化双链 D N A 片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶。在未变凝胶中分离 D N A 的缺 点是 dna聚丙烯酰胺凝胶电泳 的 迁移 率受碱 基组 成和序 列的 影响。由于无法得知未知 D N A 的迁移是 否反 常 , 故不能用未变性的聚丙烯酰胺凝胶 电泳 确定双链 D N A 的大小。二是用于分离及纯化 单链 D N A 片 段的 变性聚 丙烯 酰胺凝 胶。这 类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂 ( 尿素或甲酰胺 ) 的存在下聚合而成 , 变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关 , 故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
DNA的分子大小
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。
琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
DNA分子的构象
DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。
嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。
离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
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