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聚丙烯酰胺凝胶电泳配方

发布日期:2014-08-16 10:27:02
今天来给大家介绍一下聚丙烯酰胺凝胶电泳配方
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。聚丙烯酰胺凝胶电泳配方化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基:以R·代表自由基,M代表丙烯酰胺单体,这样由于乙烯基"CH2=CH-"一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链,同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联,从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用,所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。丙烯酰胺的另一种聚合方法是光聚合,催化剂是核黄素,核黄素在光照下能够产生自由基,催化聚合反应。一般光照2-3小时即可完成聚合反应。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在3%-30%之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,聚丙烯酰胺凝胶电泳配方可用于平板等电聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如10%-20%的凝胶常用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C,T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是: C = 6.5-0.3T
上式中a为丙烯酰胺的克数,b为甲叉双丙烯酰胺的克数,m为水或缓冲液体积(ml)。式中a与b的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶,a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是:
此式可用于计算T为5%~20%时的凝胶组成。C值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 ±1%,当C保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T的增加而减小,当T保持恒定,C为4%时,有效孔径最小,C大于或小于4%时,有效孔径均变大,C大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C是2.6%和3%。
配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月,在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。聚丙烯酰胺凝胶电泳配方丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂,操作时要避免直接接触皮肤,但它们聚合后则无毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷,它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用,因而可以得到较高的分辨率,尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性,对于生物大分子的鉴定有重要意义,其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳,电泳后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,对某个特定的生物大分子进行鉴定,另一半用于所有样品的染色,以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有:①可以随意控制胶浓度"T"和交联度"C",从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9 ~10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳配方没有带电的其他离子基团,化学惰性好,电泳时不会产生"电渗"。④由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存。⑥无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的,玻璃管通常直径为7 mm,长10 cm,将凝胶装入到多个管中进行电泳,又称为柱状电泳。目前仍有应用,尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异,所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品,电泳过程中样品所处的条件比较一致,样品间可以进行更好的比较,重复性也更好,所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛,常用于蛋白质及DNA序列分析过程中DNA片段的分离、鉴定。
水平平板电泳近年来也有很快的发展,与垂直平板电泳相比也有其独特的优点:①由于凝胶可以直接铺在冷却板上,容易使凝胶冷却,因而可以加高电压以提高分辨率。②电泳速度快,通常只要1小时左右,而园盘电泳和垂直平板电泳一般需要3~4小时。③因为可以使用薄胶,加样少,染色快,从而提高了灵敏度,而且容易保存,只要用甘油浸泡后自然干燥即可长期保存不会龟裂。④便于适用各种电泳方式,用途广泛,尤其是可以使用90年代才发展起来的只有水平电泳系统才能使用的新的半干技术,即用浸有少量缓冲液的半干的胶条代替通常所用的大量电极缓冲液,聚丙烯酰胺凝胶电泳配方大大节约了试剂,简化了操作,提高了电泳速度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA序列差异的有效手段,变性凝胶电泳在我室广泛使用,但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术,简称SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism,单链构象多态性)。
原理:在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)被变性成为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象,即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下,聚丙烯酰胺凝胶电泳配方用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,单链DNA的迁移率和带型,都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 
SSCP与变性凝胶电泳基本一致,不同之处有以下几点:
a. SSCP使用非变性凝胶进行电泳,即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶(丙烯酰胺 80g,N- N,-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g,10×TBE 50ml,加水定容到1L)
b. 工作环境,由于SSCP受温度影响,所以在电泳过程中应防止温度的升高,所以电泳环境为电压400V,电流50mA,单板电泳功率为9W,不用预热。缓冲液最好用新配制的。
c. 由于电泳功率较低,所以电泳时间较长,通常需要10小时以上,因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质,聚丙烯酰胺凝胶电泳配方小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大,可回收,DNA纯度高。在催化剂TEMED(N-N-N,- N,-四甲基乙二胺)和过硫酸胺的作用下,丙烯酰胺聚合成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N- N,-亚甲双丙烯酰胺的参与下,聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。
1.1 配制30%丙烯酰胺:丙烯酰胺29g
                     N- N,-亚甲双丙烯酰胺    1g
                     加水至100ML,40C棕色瓶可保存二月
1.2 配制5×TBE缓冲液:
                       TRIS碱      54克
                       硼酸        27.5克
                       EDTA       3.72克
                      加水至1L
1.3 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积
 
试剂
制备不同浓度(%)凝胶所用试剂体积(ml)
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%过硫酸铵
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围
 
丙烯酰胺(%)
有效分离范围(bp)
二甲苯氰FF
溴酚蓝
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤
2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板,取出上面的残胶
2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净
2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 带凹口的背板涂上硅化剂,面板则涂上粘合剂,防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能(涂摸要均匀)
2.6 面板在下,背板在上。两侧用塑料板密封,并用夹子夹好。底部调节使之水平
2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下,插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位
2.8 室温聚合30分钟,小心取出凹口处封条,用水冲洗加样孔(否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面,引起DNA带变形)
2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里,面向缓冲液槽
2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽,接上电极,打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V,电流150-200mA,单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。 
2.11 点样之前需切断电源,用枪将点样孔的气泡及胶吹出,然后插入点样梳,注意不要插得太深,否则点样胶面会变形,影响美观及点样。
2.12枪吸加样品,PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右,接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样,点样完毕,电泳开始。
 2.13 电泳至所需位置后,切断电源,拔出导线,回收缓冲液,卸下玻璃板。在工作台上,将背板撬起,放回原处。将面板进行银染
3. 电泳后的银染检测
3.1 原理:
影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒,这样核酸电泳带就染成了黑褐色。
3.2 银染
  银染液的配制:称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
  银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧,使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。
      将加入银染液的银染盆放在摇床上后,将面板放入银染1小时左右。
3.3 显影
显影液的配制:NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml,加水1200ml
显影:将面板从银染盆里取出,在银染漂洗盆里漂洗,震荡5-6次,取出后使其表面尽量无水,再放入已加入显影液的显影盆里(显影,聚丙烯酰胺凝胶电泳配方显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行)显影过程大约10到15分钟,以DNA条带清晰可见为准。
将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后,方可读带。
本实验室凝胶电泳相关常用试剂配方:
1. 我实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶是6%变性聚丙烯酰胺凝胶(简称变性胶,PAGE),聚丙烯酰胺凝胶电泳配方就是在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂。我们使用的变性剂是尿素。
6%PAGE具体配制方法为:
尿素210g,10×TBE 25ml ,丙烯酰胺28.5 g ,亚甲双丙烯酰胺 1.5g,加水定容至500ml,过滤后使用。
考虑到方便使用的问题,一般一次配制2L(尿素840g,10×TBE100ml,丙烯酰胺114g,亚甲双丙烯酰胺6g)。
2. 10×TBE(Tris-硼酸-EDTA)的配制
EDTA 7.44g,硼酸55g,Tris 108g,加水定容至1000ml
3. 10%过硫酸氨(AP)
10g过硫酸氨,纯水定容至100ml
4. 硅化剂配方
二甲基二氯硅烷:无水乙醇=13ml:500ml
5. 反硅化剂(粘合剂)配制
无水乙醇 500ml(一瓶),44ddH2O,3.3冰醋酸,550ul Bind silnce(3,-Trimethoxysilyl propyl)
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配制
0.1g 二甲苯氰,0.1g 溴酚蓝,1ml 0.5molEDTA ,100mL甲酰胺
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