联系我们 / Contact

  • bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐
  • 联系人:王经理
  • 电 话:0533-8299008
  • 手 机:13280657534 15564462387
  • 传 真:0533-8299009
  • 邮 箱:sddachina@163.com
  • 网 址:http://www.elparais.com/
  • 地 址:山东省淄博市周村区开发区工业园16号

更多专业知识

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

发布日期:2014-08-12 11:15:16
最大的不一样是聚丙烯酰胺凝胶电泳原理(PAGE)用的蛋白质不做任何变性处置
SDS-PAGE中的SDS是十二烷基磺酸钠,是蛋白质变性剂,SDS能离散蛋白质的折叠构造,然后沿扩展的多肽链的外表吸附。使肽链带净负电荷,蛋白质在电场中的泳动速度仅与蛋白质颗粒巨细有关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理是由丙烯酰胺(简称Acr)单体和少数交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)经过化学催化剂(过硫酸铵),四甲基乙二胺(TEMED)作为加快剂或光催化聚合效果构成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶构成网状构造。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳通常可分红12~25个组分。因而适用于不一样相对分子质量物质的别离,且别离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,效果:用于别离蛋白质和寡核苷酸。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状构造,具有分子筛效应。它有两种方式:非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的进程中,蛋白质能够坚持完好状况,并依据蛋白质的分子量巨细、蛋白质的形状及其所顺便的电荷量而逐步呈梯度分隔。
而SDS-PAGE仅依据蛋白质亚基分子量的不一样就能够分隔蛋白质。该技能开端由shapiro于1967年建立,他们发如今样品介质和丙烯酰胺凝胶中参加离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳搬迁率首要取决于亚基分子量的巨细(能够疏忽电荷要素)。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)  聚丙烯酰氨凝胶电泳,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支撑介质的一种常用电泳技能。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合进程由自由基催化完结。催化聚合的常用办法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加快剂。在聚合进程中,TEMED催化过硫酸铵发生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间发生甲叉键交联,然后构成三维网状构造。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理依据其有无浓缩效应,分为接连系统和不接连系统两大类,接连系统电泳系统中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场效果下,首要靠电荷和分子筛效应。不接连系统中因为缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不接连性,带电颗粒在电场中泳动不只有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其别离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不接连系统由电极缓冲液、浓缩胶及别离胶所构成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。别离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲系统、3种pH值使不接连系统构成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不接连性,这是样品浓缩的首要要素。
SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能开裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,损坏蛋白分子的二、三级构造。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键开裂。在样品和凝胶中参加还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不一样分子间的电荷区别和构造区别。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理通常选用的是不接连缓冲系统,与接连缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。
浓缩胶的效果是有堆积效果,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的搬迁效果而被浓缩至一个狭隘的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开端后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少数的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因而一起向正极移动,其间氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开端时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因而在后面构成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而发生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子敏捷移动,构成以安稳的界面,使蛋白集合在移动界面附近,浓缩成一中间层。
此鉴定办法中,蛋白质的搬迁率首要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
一、意图需求
(1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理和技能
(2)学习和把握SDS-聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳别离蛋白质技能
二、试验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理是由丙烯酰胺(简称Acr)单体和少数交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)经过化学催化剂(过硫酸铵),四甲基乙二胺(TEMED)作为加快剂或光催化聚合效果构成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶构成网状构造。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳通常可分红12~25个组分。因而适用于不一样相对分子质量物质的别离,且别离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理材料的特性
人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学系统的构成及功用:
Acr:丙烯酰胺
Bis:甲叉双丙烯酰胺
AP:过硫酸铵——化学催化剂
TEMED:四甲基乙二胺——加快剂
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理是一种阴离子去垢剂,SO32-带负电荷。在富含强还原剂的SDS溶液中可构成SDS-蛋白质复合物。因为结合很多带负电荷的聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,比如蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质自身带有的电荷则被掩盖了。然后起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷区别的效果。
三、试验材料
(一)试剂
1、30%丙烯酰胺混合液(Acr:Bis 为29:1) 称取丙烯酰胺(Acr)29g及甲叉丙烯酰胺(Bis)1.0g,用去离子水溶解并稀释至100ml,贮棕色瓶中于4℃保留,可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液  取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷(Tris)36.6g,加双蒸馏水至80ml使其溶解,调pH至8.8,然后用双蒸馏水稀释至100ml,置棕色瓶中,4℃储存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液  取1mol/L HCL溶液48ml,Tris5.98g,加双蒸馏水至80ml,调pH6.8,用双蒸馏水稀释至100ml,置棕色瓶中,4℃储存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液   称取Tris 6g、甘氨酸28.8g,加蒸馏水850ml,调pH至8.3,加蒸馏水到1000ml,4℃储存。用时可做10倍稀释。
5、10% 过硫酸铵(AP)(6)四甲基乙二胺(TEMED)或β-二甲基氨基丙腈(DMAPN)。
6、10%SDS(十二烷基磺酸钠) 称取SDS 10g,bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐:加蒸馏水100ml使其溶解。
7、四甲基乙二胺(TEMED)
8、上样缓冲液  取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml,蔗糖10g,SDS 2.3g,1g/L溴酚蓝10ml,加蒸馏水溶解,混合至100ml。
9、考马斯亮蓝染色试剂  考马斯亮蓝R250染色液:浓度为2.5g/L,用甲醇∶醋酸∶蒸馏水=5∶1∶5的溶液制造(V/V)。
10、脱色液:取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml,加蒸馏水至100ml。
11、样品:人血清。
12、蛋白质分子量象征物  市售中分子量蛋白质分子量象征物。也可选择5种以上的已知分子量蛋白质自行制造,留意其分子量散布要能满足需要,各种蛋白质的浓度根本持平。
(二)仪器  圆盘电泳槽(或垂直板电泳槽)、稳压稳流电泳仪  、脱色摇床。
四、试验办法
(一)预备圆盘电泳槽、电泳仪。
(二)凝胶制备  按下表分别制造别离胶和浓缩胶(此量可供2人用)
别离胶(12%   5ml)        浓缩胶(5%   2ml)
ddH2O        1.6ml        1.4ml
30%混合液        2.0ml        0.33ml
1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl        1.3ml        —
1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl        —        0.25ml
10%SDS        50µl        20µl
10%Ap        50µl        20µl
TEMED        4µl        4µl
留意:边配边平摇烧杯混匀,配好胶后敏捷用滴管灌胶
(三)灌胶
1、先将胶管(5х90mm)封好底,将制造好的别离胶液灌写入胶管内,约70mm高度(把握别离胶的高度),在凝胶外表悄悄加一层正丁醇液(约3~4mm)。用于隔绝空气,使胶面平坦。室温下静置约30~60min。调查胶和正丁醇之间的界面,判别胶是不是凝结。要在承认别离胶完全凝结后才开端制造浓缩胶。
2、别离胶凝结好后,倒掉掩盖在别离胶外表的正丁醇,并用去离子水冲刷一次,倒置吸净残留的水。将制造好的浓缩胶液灌写入胶管内(约15mm),在凝胶外表悄悄加一层正丁醇液(约3~4mm),用于隔绝空气,使胶面平坦。室温下静置约30~60min。调查胶和正丁醇之间的界面,判别胶是不是凝结。胶凝结好后,倒掉掩盖在胶外表的正丁醇,并用去离子水冲刷一次,倒置吸净残留的水,预备加样。
(四)样品预处置和加样
1、取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml,混匀,在沸水中煮沸5min。
2、将胶管封底去掉,放入圆盘电泳槽中,套紧,不能有空的孔,将Tris-甘氨酸电泳缓冲液参加圆盘电泳上、下槽中,电泳缓冲液要盖过胶管口,然后用微量加样器(或注射器)将样品10μl加到胶管胶面内。
(五)电泳  上槽接负极,下槽接正极,先调电压为120v/浓缩胶,开端电泳,当指示染料进入别离胶后,将电压增加到80v/别离胶胶,持续电泳直至染料抵达距别离胶下端约1cm处,中止电泳,断开电源。电泳时刻约1.0~1.5h。
(六)考马斯亮蓝染色
电泳结束后,取出电泳胶管,用长注射器针剥胶,一边灌水一边推胶,直至胶出。将胶移至大培养皿中,准确量取并记载凝胶长度和指示染料的搬迁间隔(别离胶上缘到染料条带中间间隔),然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h,再用脱色液脱色1~2天,至背景无色停止。区带可作定性或定量剖析。
(七)校正曲线的数据处置和分子量测定  准确量取并记载染色后凝胶长度、各象征蛋白质和各待测蛋白质区带的搬迁间隔(别离胶上缘到各蛋白质区带中间)。按下式核算各蛋白质的相对搬迁率(Rm值)。
在半对数纸上,以各象征蛋白质的Rm值为横坐标(一般标准),相应的分子量为纵坐标(对数尺刻度)作图,即得分子量校正曲线。依据各待测蛋白质的Rm值,查此校正曲线,可求各待测蛋白质的相对分子量。
五、留意事项
1.制胶进程中用正丁醇封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制效果。
2.本法也适合于其他生物样品中蛋白质的剖析。上样量不宜过大,不然会呈现过载表象。尤其是考马斯亮蓝R250染色,在蛋白质浓度过高时,染料与蛋白质的氨基(-NH)构成的静电键不安稳,其结合不符合Beer规律,使蛋白质量不准确。
3.Acr和Bis有神经毒性,可经肌肤、呼吸道等吸收,故操作时要留意维护。
本文推荐企业:bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐(http://www.elparais.com/),是专业的阴离子聚丙烯酰胺,阳离子聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺生产厂家,专业生产聚丙烯酰胺,阴离子聚丙烯酰胺,阳离子聚丙烯酰胺,非离子聚丙烯酰胺。拥有雄厚的技术力量,先进的生产工艺和设备。东达聚合物有限公司全体员工为海内外用户提供高技术,高性能,高质量的聚丙烯酰胺产品。专业聚丙烯酰胺生产厂家:bbo必博_bbo必博官网_bbo必博娱乐热忱欢迎国内外广大客户合作共赢。
上一篇:聚丙烯酰胺毒性
下一篇:聚丙烯酰胺msds